kerafast 4014C1-2細胞系說明書 

4B6 / 3598/3442＃2/4011 / 4014C1-2細胞系

該鼠成纖維細胞系是4B6 / 3598/3442＃2 / 4011C1細胞系（目錄號ESA104）的衍生物，并將mtDNA保持在減少的拷貝數上。為了產生該細胞系，將維持mtDNA拷貝數在正常水平的親代細胞用質粒pMA4014瞬時轉染，該質粒編碼mCherry和FLPo，并針對轉染的細胞進行流分選。由于FLPo介導的在細菌LigA基因前面的MTS切除，導致4B6 / 3598/3442＃2/4011 / 4014C1-2細胞中線粒體LigA導入效率低下，并且mtDNA保持減少的拷貝數。該細胞系及其伴隨的同基因細胞系4B6 / 3598/3442＃2 / 4011C1（目錄號ESA104）可用于研究mtDNA拷貝數對細胞生理的影響。

來自南阿拉巴馬大學Mikhail F Alexeyev博士的實驗室。

技術指標提供者注釋參考文獻

技術指標

提供者

來自南阿拉巴馬大學Mikhail F Alexeyev博士的實驗室。

注釋

將Cre-TM小鼠（JAX 004682，B6.Cg-Tg（CAG-cre / Esr1）5Amc / J）與Lig3LoxP小鼠（Nature 471（2011）240-244）交叉雜交，以提供由肌動蛋白驅動的他莫昔芬誘導的Cre表達啟動子。從E13.5胚胎間充質制備Lig3Cre-TM小鼠胚胎成纖維細胞（MEF）。用編碼SV40大T抗原的逆轉錄病毒構建體3315使細胞永生（J.Biol.Chem.288（2013）26594-26605），并根據其形成菌落的能力進行選擇。選擇了一個克隆，以其優異的生長特性命名為Cre4。用逆轉錄病毒2641（Mol.Biol.Rep.37（2010）1987-1991，其編碼Tet-On Advanced反式激活子，EGFP和殺稻瘟素抗性）轉導該克隆，從而產生命名為4B6的克隆。4B6是Cre4的Tet-On衍生物。用逆轉錄病毒rv3598（G418抗性）和rv3442（嘌呤霉素抗性）進一步轉導Cre4，從而通過Cre介導的切除（rv3442）使細胞Lig 3基因失活，并重新表達沒有線粒體靶向信號的細菌LigA基因（ MTS，rv3598）。在不存在限制mtDNA復制的Lig 3的情況下，LigA的線粒體導入效率低下會使DNA連接酶活性升高，并導致mtDNA拷貝數降低。這些細胞用逆轉錄病毒rv4011轉導，該病毒編碼與來自人鳥氨酸轉氨甲酰酶的可激發的（FLPo）線粒體靶向序列融合的相同LigA。該融合蛋白被有效地導入線粒體，因此在轉導的細胞中恢復了正常的mtDNA拷貝數。后，用編碼mCherry和FLPo的質粒4014瞬時轉染得到的細胞。由于FLPo介導的從LigA去除MTS，因此降低了所得克隆＃4B6 / 3598/3442＃2/4011 / 4014C1-2中的mtDNA拷貝數。該細胞系與同基因細胞系4B6 / 3598/3442＃2 / 4011C1結合使用，可用于研究mtDNA拷貝數對細胞生理的影響。

參考文獻

1. Spadafora D，Kozhukhar N，Alexeyev MF。DNA連接酶的不依賴于序列的線粒體導入有助于減少mtDNA拷貝數的細胞系的建立。PLoS一。2016三月31; 11（3）：e0152705。