點突變試劑盒1.0說明書

上海起發(fā)生物科技有限公司（Shanghai BioHub Biotechnology Co., Ltd.）屬于上海起發(fā)實驗試劑有限公司（2009年成立）旗下的子公司，成立的初衷是建立上海起發(fā)生物自有品牌，打造優(yōu)質的生物試劑民族自有品牌。降低成本的同時，把好生物產業(yè)鏈中的國產生物試劑品質關。未來讓每一個和我們一樣擁有民族情懷的企業(yè)，共同創(chuàng)世界優(yōu)秀的中國生物制造企業(yè)，圓夢中國。

產品詳情

產品描述

本試劑盒可以在質粒DNA序列中任意位點引入特定的定突變，包括堿基插入、堿基deletion、堿基變換等。

首先用高保真DNA聚合酶與帶有突變堿基與硫代修飾的引物，PCR擴增野生型質粒，將質粒線性化并引入突變位點，然后用化學重組試劑將質粒重組成環(huán)狀質粒。擴增質粒的一對引物各自5'末端的10-12個堿基互補配對，用于重組環(huán)化質粒。將帶有突變堿基的線性化質粒PCR產物用化學重組試劑處理環(huán)化質粒，然后進行DH5a轉化，完成基因定點突變。

本公司化學法突變試劑盒含有高保真DNA聚合酶2XPCR Mix、化學重組試劑，可以從頭到尾完成整個實驗，極大的方便了實驗操作。另有無高保真DNA聚合酶2XPCR Mix的化學法突變試劑盒。

產品特點

DNA定點突變，包括堿基插入、堿基deletion、堿基變換等。

產品組分

使用方法

使用方法

01. 設計突變引物

引物設計總原則：在正反向擴增引物的5'端引入末端互補同源序列，使擴增后的線性化質粒片段5'和3'末端帶有10-12個堿基的同源序列，用于重組環(huán)化質粒。

l 正向擴增引物設計原則：5'-末端同源序列+突變位點+硫代修飾位點+目標序列特異性正向配對序列-3'

l 反向擴增引物設計原則：5'-末端同源序列+突變位點+硫代修飾位點+目標序列特異性反向配對序列-3'

l 正／反向擴增引物與質粒模板的特異性配對序列Tm值55-65℃為佳，末端同源區(qū)序列長度為10-12 個堿基（一般情況同源區(qū)10個堿基足以）。

l 一般引物不需PAGE純化，如果最終引物長度超過40 bp，推薦合成時選用PAGE純化，有助于提高PCR與點突變成功率。

02. 反向PCR擴增線性化質粒，并引入突變位點

為了防止突變位點之外的堿基額外突變，確保使用高保真聚合酶進行反向PCR。50ul的PCR體系中，推薦使用1-5ng 環(huán)狀質粒模板。限制性內切酶DpnI處理PCR產物，可以降低野生型質粒形成的克隆數。由于本突變試劑盒效率高，可省略DpnI消化處理，對突變成功率影響不大。

03. 重組環(huán)化反應的線性化質粒使用量

無需精確計算化學法重組反應的線性化質粒PCR產物加入量，一般使用3-5ul。

04. 質粒重組環(huán)化反應

（1）室溫配制以下反應體系：

組分            重組反應^a     陰性對照^b       陽性對照^c

線性化質粒       X μl           X μl              5 μl

化學重組試劑     2 μl           0 μl              2 μl

ddH₂0         to 10 μl        to 10 μl           to 10 μl

a. 割膠純化的PCR產物進行重組反應時，一定在重組反應體系中加入1/10體積的化學重組Buffer

b. 用來確認野生型環(huán)狀質粒殘留，推薦進行。

c. 突變線性質粒DNA陽性對照反應可用來排除其他實驗材料及操作因素的影響。

（2）輕柔混勻后，在70℃反應8-10 min，置于室溫或冰上冷卻。

u 在PCR儀及其它加熱儀器上進行反應，重組環(huán)化效率在反應8-10 min左右達到最高。

u 重組環(huán)化產物可于-20℃存放1個月，待需要時解凍轉化即可。

05．重組環(huán)化質粒產物轉化

u 在冰上解凍克隆感受態(tài)細胞，冰上放置15min

u 取5ul重組環(huán)化產物加入到50ul感受態(tài)細胞中，輕彈管壁混勻(請勿振蕩混勻)，冰上靜置15-20 min。重組產物轉化體積最多不應超過所用感受態(tài)細胞體積的1/5；

u 42℃水浴熱激1-2min后，立即置于冰上冷卻1- 2 min。

u 加入450 μl SOC或LB培養(yǎng)基(不添加抗生素)，37℃搖菌30min-1h (轉速200 - 250 rpm)。

u 將相應抗性的LB平板固體培養(yǎng)基在37℃培養(yǎng)箱中預熱30min（可省略）。

u 直接吸取20-100ul菌液到含有正確抗性的平板上，用無菌涂布棒涂勻。

37℃培養(yǎng)箱中倒置培養(yǎng)12 - 16 h。

06．點突變測序鑒定

u 過夜培養(yǎng)后，重組環(huán)化反應轉化平板上形成數百個單克隆，而不加化學重組試劑的陰性對照反應轉化平板上的克隆數應顯著少于前者。

u 挑取重組反應轉化平板上2-3個克隆進行DNA序列測定，驗證是否突變成功。

注意事項

為了您的安全和健康，請穿實驗服并戴一次性手套操作！

本產品主要用于科研領域，不宜用于臨床診斷或其他用途。

運輸及保存方法

干冰運輸。-20℃保存，有效期2年。