上海起發(fā)為InvivoGen國(guó)內(nèi)代理商，美國(guó)InvivoGen Invivogen 主要提供抗生素，轉(zhuǎn)染試劑，細(xì)胞因子，細(xì)胞系，質(zhì)粒等產(chǎn)品。抗生素涵蓋了細(xì)胞培養(yǎng)、篩選全系列，如Blasticidin S,Hygromycin B , Phleomycin, Primocin,   Zeocin等細(xì)胞分選常用抗生素。尤其以抗細(xì)胞支原體污染的抗生素Plasmocin™zui為出名，該抗生素因其性能受到客戶*。

品牌：Invivogen

貨號(hào)：pcpgf-bas

品名：pCpGfree-basic with mSEAP reporter gene  帶有mSEAP報(bào)道基因的pCpGfree-basic

規(guī)格：20 µg

pCpGfree-basic是*不含CpG二核苷酸的報(bào)道質(zhì)粒。這些質(zhì)粒缺乏完整的啟動(dòng)子區(qū)域（與pCpGfree質(zhì)粒相比）。

pCpGfree-堿性質(zhì)粒在mSEAP或Lucia（一種分泌型熒光素酶報(bào)告基因）上游含有多克隆位點(diǎn)（MCS）。報(bào)道基因在用該質(zhì)粒轉(zhuǎn)染的細(xì)胞中的表達(dá)取決于在報(bào)道基因上游插入功能性啟動(dòng)子或增強(qiáng)子/啟動(dòng)子盒。

因此，pCpGfree堿性質(zhì)粒允許單獨(dú)研究CpG甲基化對(duì)啟動(dòng)子的影響，或與增強(qiáng)子元件組合。

產(chǎn)品規(guī)格

•不含CpG的質(zhì)粒骨架

•不含增強(qiáng)子/啟動(dòng)子區(qū)域的報(bào)告質(zhì)粒：

   - 鼠分泌的堿性磷酸酶（SEAP）

   - 分泌型熒光素酶（Lucia）

•可在含Zeocin™的大腸桿菌中選擇

本產(chǎn)品受限制使用許可（請(qǐng)參閱條款和條件）。

內(nèi)容

•提供20μg作為凍干DNA的pCpGfree-堿性質(zhì)粒

•將大腸桿菌 GT115菌株凍干在紙盤(pán)上

•4袋大腸桿菌 Fast- Media®Zeo（2 TB和2瓊脂）

描述

質(zhì)粒特征

在大腸桿菌中復(fù)制和選擇質(zhì)粒所需的所有元件和哺乳動(dòng)物細(xì)胞中的基因表達(dá)*沒(méi)有CpG二核苷酸。此外，所有Dam甲基化位點(diǎn)（GATC）已被去除以防止原核甲基化。

用于在大腸桿菌中表達(dá)的元件

•復(fù)制起點(diǎn)：大腸桿菌 R6K gamma ori已被修飾以去除所有CpG。該起源由pir基因編碼的R6K特異性啟動(dòng)子蛋白π激活[1]。

•細(xì)菌啟動(dòng)子：EM2K是細(xì)菌EM7啟動(dòng)子的無(wú)CpG版本。

•選擇標(biāo)記：Zeocin™抗性基因是一個(gè)含有大量CpG二核苷酸的小基因（<400 bp）。一個(gè)合成的新等位基因被創(chuàng)建，不含CpGs。

用于在哺乳動(dòng)物細(xì)胞中表達(dá)的元件

•合成的mSEAPΔCpG基因：通過(guò)化學(xué)合成構(gòu)建的鼠SEAP基因的無(wú)CpG等位基因。

•聚腺苷酸化信號(hào)：聚腺苷酸化信號(hào)是晚期SV40聚腺苷酸化信號(hào)的無(wú)CpG形式。

MAR：基質(zhì)連接區(qū)域（MAR）是典型的富含AT的序列，能夠在獨(dú)立調(diào)控的結(jié)構(gòu)域之間形成屏障[2]。pCpGfree質(zhì)粒含有來(lái)自人IFN-β基因或β珠蛋白基因的5'區(qū)域的兩個(gè)MAR，因?yàn)樗鼈兲烊徊缓珻pG，所以被選擇。MARs被放置在細(xì)菌和哺乳動(dòng)物轉(zhuǎn)錄單位之間。

•MCS：多克隆位點(diǎn)包含幾個(gè)常用的限制性位點(diǎn)，以方便克隆感興趣的基因。5'Sda I，Bsp 120I，Avr II，Nsi I，Ppu 10I，Sca I，Bam HI，Spe I 3'

由于存在R6Kγ復(fù)制起點(diǎn)，pCpGfree-basic只能在表達(dá)pir突變基因的大腸桿菌突變株中擴(kuò)增。它不會(huì)在標(biāo)準(zhǔn)大腸桿菌菌株中復(fù)制。因此，pCpGfree-basic與大腸桿菌 GT115菌株一起提供，該菌株也是Dcm甲基化缺陷的pir突變體。

1. Wu F.等人 1995.對(duì)R6Kγ-起源核心復(fù)制子賦予穩(wěn)定維持的DNA片段。J Bacteriol。177（22）：6338-45。

2. Bode J.等，1996。支架/基質(zhì)附著區(qū)：具有多種調(diào)節(jié)功能的拓?fù)溟_(kāi)關(guān)。Crit Rev Eukaryot Gene Expr。圖6（2-3）：115-38。

細(xì)節(jié)

基于pCpGfree的骨干

MCS： 5'-SdaI，Bsp120I，AvrII，NsiI，Ppu10I，ScaI，BamHI，SpeI，HindIII-3'

程序

1-將啟動(dòng)子和/或增強(qiáng)子片段插入pCpGfree-basic

2-用CpG甲基化酶（Sss I）或位點(diǎn)特異性甲基化酶（Hha I，Hpa II）處理重組質(zhì)粒。

3-用甲基化酶處理或未處理的質(zhì)粒瞬時(shí)轉(zhuǎn)染細(xì)胞。

4-通過(guò)使用適當(dāng)?shù)臋z測(cè)試劑確定報(bào)告子表達(dá)來(lái)分析啟動(dòng)子CpG甲基化。

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